免疫组化技术在辅助病理诊断和鉴别诊断过程中经常起决定性作用，同时对肿瘤患者个体化治疗及预后评估也起到了重要的指导性作用。

免疫组化过程及注意事项

1、组织固定目的是为了保存良好的组织形态及结构，防止组织自溶。所以标本离体后30min内应剖开固定或低温保存，固定时间以8～24h为宜，4％中性甲醛渗透力强，固定均匀，抗原保存好，为首选固定液。

2、玻片选择对大多数病理科而言，一般多使用多聚赖氨酸的挂胶片，适用范围广，价格便宜；但有条件的科室可以选择阳离子免疫组化玻片，效果更佳。

3、组织切片石蜡组织切片要薄，厚度一般为3～4μm，无缺损、皱纹、折叠、气泡，烤片温度65～68℃，脱蜡要净。烤片忌高温或重复烘烤，以防止抗原扩散及丢失。

4、抗原修复直接影响免疫组化检测结果的可靠性。在进行免疫组化染色时并非所有的抗原都要进行抗原修复，抗原性保存良好或基本保存者不需要修复。不同抗体必须选择最适合的修复方法，最常用的是热修复法，尤其是细胞核抗原经热修复后，染色效果特别好。热修复包括水煮加热、高压加热和微波加热3种。

热修复法影响抗原修复的关键因素有2个：

①温度：高压加热时间为2～3min，水煮加热时间为25～30min；

②修复液的种类和pH值：应与修复方法和修复时间相对应。所以必须严格按照抗体使用说明书进行抗原修复。鉴于抗原修复的方法较多，在实际工作中，究竟选用何种抗原修复，应根据抗体种类予以选择，要清楚影响抗原的因素及各种抗原修复的方法，必要时可以多种方法同时使用，这样更具有针对性，标记结果更理想。虽然有学者认为，修复液沸腾时的气泡容易导致脱片，但组织处理不佳是最重要的影响因素。

5、抗体的选择及使用要选择适宜的一抗，不同的二抗与一抗浓度不匹配，都不能得到满意的结果。在滴加一抗、二抗时要先轻轻倾去PBS液，选用韧性好、吸水性强的纸巾吸干组织周围液体，轻压组织面吸干组织表面水分（不能滑动），防止试剂被稀释或致浓度不均，立即滴加适量试剂，用细玻棒将试剂扩展至组织外1～2mm，防止出现边缘效应，不能触碰组织，液面厚约1mm为宜。试剂表面的气泡用玻棒点破，否则气泡张力作用会导致局部无试剂，出现气泡下假阴性反应。湿盒孵育要定恒温，整个过程均要防止干片，孵育时必须加盖。

6、显色及复染DAB显色剂须现配现用，10min内用完。显色时间也不同程度影响免疫组化的质量，最好镜下控制显色，一般把握在3～5min，所以操作者应具备常用抗体定位的知识。显色后用苏木精复染，注意要淡染。

容易被忽视的问题

试剂的保存因为抗体是蛋白质，保存或使用不当不但会造成浪费，而且变质会出现假阴性结果。要注意抗体的有效期，对于一次用不完的抗体可保存在冰箱内，而不要放在冷冻室，反复冻融，抗体效价会急剧下降而失效。同时防止抗体的相互交叉污染和细菌污染。

环境温度标准实验室温度是18～22℃，实际工作中却不然，条件差的实验室冬天可低于12℃，夏天可高于37℃，冬夏温差可达到25℃。一切酶促反应温度最关键，反应程度也是冬夏季有别，这也是造成染色结果不稳定的一个重要原因，因此应该选用37℃恒温箱进行孵育。

异常染色结果及原因①脱片：黏胶玻片不合格、组织固定脱水透明不充分、切片太厚、实验中干片等；

②花斑状着色：脱蜡不净、切片厚薄不匀、切片时组织下有气泡或组织不规则松脱、试剂加样时有气泡或组织表面残留水分太多、干片等；

③边缘效应：指组织切缘非正常着色。因一抗二抗加量少，试剂没有扩展至组织外或没有在封闭湿盒中孵育，水分挥发使边缘抗体浓度增大、组织边缘松脱或干片；

④非特异性背景着色：染色过程中干片或冲洗不彻底；血清蛋白密封不充分；内源性过氧化物酶未完全阻断；内源性生物素未阻断（肝、肾、胰腺，含有中性粒细胞组织）；固定不及时或固定不佳；切片太厚；缓冲液酸碱度未达标。

综上所述，人工免疫组化染色操作简单，但人为及环境影响因素较多，必须有高度的责任心和娴熟的操作技术，严格按操作流程操作，完善室内环境监控，尽可能的减少或杜绝人为和环境的干扰，才能取得满意的结果。